棉花收获机械化势在必行，而选育和推广与之相适应的机采棉新品种是当务之急。开展适宜高度密植、机械化采摘的棉花株型改良育种已引起我国棉花育种家的高度重视。以往作物株型的改良主要是在发现或创造优异材料的基础上进行常规育种，育种周期长，可预见性较差。近年来，基于对矮秆突变体广泛的研究，发现油菜素类固醇(brassinosteroid, BR)和赤霉素(gibberellin, GA)参与了节间的发育过程，并相继克隆了一批控制株型性状的基因(如拟南芥基因GAI, RGA, DET2, cpd和dwf4; 小麦的Rht1; 玉米的Dwarf8等)，为通过分子手段设计和改造作物株型提供了可能(胡珀和韩天富, 2008)。DET2是调控油菜素类固醇生物合成的一个关键基因，它的突变将导致植物表现出去黄化、矮化和丧失光调节机能等特征(Sun et al., 2004; Belkhadir and Chory, 2006)。Luo等(2007)研究GhDET2基因对棉花生长发育和纤维品质的影响，超量表达和反向抑制GhDET2基因都导致棉花植株矮化、侧枝变短。但是棉花种质本身就具有紧凑株型和松散株型，这两类种质间基因组中GhDET2基因序列的异同尚无报道。本研究拟以一份松散型棉花种质为对照，重点分析其与机采紧凑型基因组中GhDET2基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，为探索有目的地转育不同类型GhDET2基因来调控棉花生长发育提供理论依据。

1结果与分析
1.1机采紧凑型棉花种质GhDET2基因扩增结果
 根据GenBank中DQ116446、AY141136的2条mRNA序列设计GhDET2基因引物，对供试的12份棉花种质基因组DNA分别进行PCR扩增，1.6%琼脂糖电泳检测其扩增产物，12份棉花种质中均能扩增出分子量为800 bp左右的1个目的条带(图1)。

 

图1 不同棉花种质GhDET2 基因的扩增结果 注: M: D2000 DNA ladder marker; 1~12: 参试材料650, 1343, 1348, 1349, 1357, 1359, 1360, 1363, 1367, 1379, 1391, 冀76 Figure 1 Amplified results of GhDET2  of different materials Note：M: D2000 DNA ladder marker; 1~12: The tested material 650, 1343, 1348, 1349, 1357, 1359, 1360, 1363, 1367, 1379, 1391, Ji76

1.2机采紧凑型棉花种质GhDET2基因编码区序列的比较
用Geneious Pro软件对12条测序序列及GenBank中DQ116446、AY141136的2条mRNA序列一起进行比较，发现GhDET2基因序列在14个棉种中基本一致，一致性为98.9%，仅个别碱基位点存在差异。在编码区发现18个碱基易突变位点，如图2中小箭头所示；其中涉及到编码氨基酸变化的碱基位点6个，并且发现1个松散型材料冀76的特异碱基位点(表1)。差异位点如图2所示。

图2 14份材料GhDET2基因核苷酸序列及氨基酸序列比较 Figure 2 Comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence of GhDET2 in 14 materials

表1 不同棉花种质GhDET2基因中涉及氨基酸改变的单核苷酸位点 Table 1 SNPs of GhDET2 resulted in amino acid polymorphisms in tested germplasm

1.3基于GhDET2基因编码氨基酸序列的棉花种质聚类分析
用Geneious Pro软件把14个棉种GhDET2碱基序列从参照mRNA序列的ORF处开始翻译成氨基酸序列，然后进行聚类分析(图3)。从图3我们可以看出，依GhDET2基因编码氨基酸序列可以把参试材料分为3类，7小类。第一大类包括2个小类，2条参照序列DQ116446和AY141136聚于一个类型，紧凑系1343、紧凑系1359和紧凑系1367聚于一个类群，且1359和1367氨基酸序列完全一致；第二大类仅包括松散型品系冀76和紧凑型1348，但差别比较明显被分入2个小类；第三组包含其余7份材料，可分为3个小类群，紧凑型1357单独一个小类群，源于共同紧凑型父本的1349和1363聚合为一个小类群，紧凑型材料650、1360、1379和1391氨基酸序列完全一致，处于一个小类群。棉花株型相关性状主要包括株高、果枝夹角、第四果枝第一果节长度和主茎节间长度，依据氨基酸序列相似度的聚类结果，将各种质吐絮期调查的株型相关数据排列于表2。依据棉花果枝类型分类，棉花二型果枝可根据果节的长短划分为紧凑型(果节长度3 cm~5 cm)、较紧凑型(节间长度5 cm~10 cm)、较松散型(节间长度10 cm~15 cm)和松散型(15 cm以上)。从表2我们可以看出聚类各组数据相似，根据氨基酸序列相似度的分组结果与果节长度数据符合程度很好。而与株高、果枝夹角及主茎节间长度相关程度不明显。可以推测GhDET2基因碱基序列变化引起的氨基酸的改变，可能影响到棉花果枝上果节的伸长。另一方面，参试材料紧凑系1343、紧凑系1359和紧凑系1367的果节长度小于3 cm，已经超出棉花二型果枝分类标准，表明制定原初分类标准时，或许还没有考虑到存在果节长度小于3 cm的棉花二型果枝种质。棉花二型果枝分类应该考虑加入果节长度小于3 cm指标定为超紧凑型。

 

图3 基于GhDET2基因编码氨基酸序列的不同材料的聚类图 Figure 3 clustering tree of different materials was established on DET2 amino acid sequence

表2 依据聚类分析的棉花种质株型结构数据比较 Table 2 Comparison of plant-type structure data based on the clustering analysis

2讨论
束红梅等(2012)对不同染色体组棉种的DET2基因序列进行分析认为该基因碱基序列在不同染色体组棉种中较为保守，且编码区段没有内含子。其扩增的只是DET2基因400 bp的部分区段，而非全长序列，不可能进行编码氨基酸的分析，其结果值得商榷。本研究获得了GhDET2基因编码区序列全长，与mRNA序列比对，发现在棉花基因组中该基因编码区没有内含子。且在编码区发现18个碱基易突变位点，特别是6个引起氨基酸变化的碱基突变位点，这些突变位置比较一致，说明这些突变位点并不是随意发生的，有其内在规律性。有亲缘关系的紧凑型材料基本能聚类到一起，表明碱基位点的差异存在遗传因素，但碱基序列并不是完全一样的，这些位点是否在复制过程中容易发生碱基突变，还有待于进一步研究。

油菜素类固醇是植物生长发育所必需的一类植物激素，在植物生长发育过程中具有重要的作用，包括细胞伸长和分裂、光形态建成、维管束发育、种子萌发、花器官发育、器官衰老和植物抗逆性等(储昭庆等, 2006; Bajguz and Hayata, 2009)。本研究通过对调控油菜素类固醇生物合成的一个关键基因DET2编码氨基酸序列聚类与田间数据分析，推测GhDET2基因碱基序列变化引起的氨基酸的改变，可能影响油菜素类固醇的合成代谢，进而调节棉花果枝上果节的伸长，说明依据GhDET2基因编码氨基酸序列进行聚类分析来指导紧凑型品种选育还是科学合理的。本研究只是对不同材料基因组DNA中GhDET2基因的扩增，没有延伸到表达水平，也没有涉及到油菜素类固醇在不同材料中含量的检测。株型形态建成涉及多种激素的共同作用，单一的因素分析具有很大的局限性，因此还有待于进一步的深入研究其内在关系。

3材料和方法
3.1供试材料
本研究选用了12份棉花种质，其类型、来源及有关的特征特性列于表3。其中冀76为松散型抗虫棉品系，设为对照；其余11份棉花种质为河北省农林科学院棉花所回交转育和搜集的适宜机械化采摘的紧凑型棉花新品系。所有材料种植于河北省农林科学院棉花研究所小安舍试验站用于DNA的提取和相关性状调查。
 

表3 供试材料信息表 Table 3 The information of tested materials

3.2实验方法
本研究参照Paterson等(1993)的方法提取棉花基因组DNA，根据陆地棉DET2基因(GenBank: DQ116446; AY141136)序列设计引物Forward：5'-GAAAATGGCCTCCGATCAGAC-3'和Reverse：5'-CTTCAATATATGAATGGGATC-3'。以供试材料的DNA为模板，PCR扩增条件为94℃预变性5 min，34个循环(94℃ 40 s, 54℃ 40 s, 72℃ 1 min)，72℃ 10 min。扩增产物经1.6%琼脂糖电泳检测后，送至上海Invitrogen公司测序，重复3次，正反向链测序结果用DNAMAN软件拼接，再把序列文件用DNASTAR软件转换成FASTA格式。采用Geneious Pro软件进行目的基因编码区碱基序列和氨基酸序列的比对分析。

作者贡献
郭宝生是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成论文初稿的写作；王凯辉参与田间调查；赵存鹏和杜海英参与实验设计；刘素恩参与田间数据调查；王凯辉、赵存鹏、杜海英和刘素恩参与论文的讨论与修改；耿军义是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢 
本研究由国家重大专项(2011ZX08005-005)资助。感谢中国农业大学博士研究生师恭曜在分析软件使用上的帮助。

参考文献
Bajguz A., and Hayata S., 2009, Effects of brassinosteroids on the plant responses to environmental stresses, Plant Physiol. Biochem., 47(1): 1-8

Belkhadir Y., and Chory J., 2006, Brassinosteroid signaling: a paradigm for steroid hormone signaling from the cell surface, Science, 314(5804): 1410-1411

Chu Z.Q., Li L., Song L., and Xue H.W., 2006, Advances on brassinosteroid biosynthesis and functions, Zhiwuxue Tongbao (Chinese Bulletin of Botany), 23(5): 534-555 (储昭庆, 李李, 宋丽, 薛红卫, 2006, 油菜素内酯生物合成与功能的研究进展, 植物学通报, 23(5): 534-555)

Hu P., and Han T.F., 2008, Molecular basis of stem trait formation and development in plants, Zhiwuxue Tongbao (Chinese Bulletin of Botany), 25(1): 1-13 (胡珀, 韩天富, 2008, 植物茎秆性状形成与发育的分子基础, 植物学通报, 25(1): 1-13)

Luo M., Xiao Y.H., Li X.B., Lu X.F., Deng W., Li D.M., Hou L., Hu M.Y., Li Y., and Pei Y., 2007, GhDET2, a steroid 5a-reductase, plays an important role in cotton fiber cell initiation and elongation, Plant J., 51(3): 419-430

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Shu H.M., Guo S.Q., Shen X.L., and Ni W.C., 2012, Sequencing of DET2 gene in different cotton species, Jiangsu Nongye Xuebao (Jiangsu Journal of Agricultural Sciences), 28(2): 451-453 (束红梅, 郭书巧, 沈新莲, 倪万潮, 2012, 不同棉种油菜素内酯合成酶基因DET2序列分析, 江苏农业学报, 28(2): 451-453)

Sun Y., Fokar M., Asami T., Yoshida S., and Allen R.D., 2004, Characterization of the brassinosteroid insensitive 1 genes of cotton, Plant Mol. Biol., 54(2): 221-232